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矮壮素CCC对银杏叶片光合代谢与萜内酯生物合成的影响

来源:/news/6.html  更新时间:2012-09-03

矮壮素CCC对银杏叶片光合代谢与萜内酯生物合成的影响
许锋1,张威威1,孙楠楠1,李琳玲2,程水源2,王燕3
(1长江大学园艺园林学院,湖北荆州 434025 ;2黄冈师范学院经济林木种质改良与资源综合利用湖北省重点实验室,湖北黄冈 438000 ;3黄冈市林业局,湖北黄冈 438000)

摘要:为探讨矮壮素(CCC)调控银杏叶萜内酯生物合成的机理,以3年生银杏实生苗为试材,研究了0、0.5、1.0 和2.0g·L-1CCC处理对银杏叶光合作用、光合色素、可溶性糖和萜内酯含量的影响,并采用实时定量PCR 技术(qRT-PCR )检测了对银杏萜内酯合成途径中5个关键基因表达水平的影响。结果表明,0.5、1.0 和2.0g·L-1 CCC处理均可显著提高银杏叶光合作用速率,气孔导度,细胞间CO2浓度,蒸腾速率,以及叶绿素、类胡萝卜素和可溶性糖的含量。在1.0和2.0g·L-1CCC处理下,银杏内酯A、银杏内酯B、白果内酯和总萜内酯含量显著高于对照。qRT-PCR 分析结果显示CCC处理能显著上调银杏内酯合成途径中4个关键基因(DXS 、DXR 、GGPPS、LPS)的表达,表明CCC在分子水平上可能是通过诱导内酯合成关键基因表达来促进内酯的生物合成。
关键词:银杏;矮壮素;光合作用;可溶性糖;萜内酯;关键基因 

  银杏(Ginkgo biloba L.)萜内酯是银杏中具有的成分,具有重要的药用价值(Strm ? gaard & Nakanishi,2004)。目前研究较多的是银杏内酯 A(ginkgolide A,GA)、银杏内酯B(GB)、银杏内酯C(GC)和白果内酯两类( bilobalide,BB)(van Beek & Montoro ,2009)。由于银杏含萜内酯含量很低,探索适宜提高银杏萜内酯含量的方法极有必要。
  矮壮素(chlorocholine chloride,CCC)是赤霉素拮抗剂,是常用的植物生长抑制剂,能有效地使植物矮化,提高作物产量。亦有研究表明CCC也能促进植物次生代谢产物的积累,最早由Grebinskii和Khmil(1980)发现外源施用CCC能增加卷心菜和紫鸭拓草中花青苷的含量。程水源等(2004)的研究结果表明叶面喷施CCC能显著提高银杏叶黄酮含量。尽管冷平生等(2004)也报道了叶面喷施CCC能增加银杏萜内酯含量,但有关CCC调节银杏萜内酯含量的生理与分子机制尚未见报道。
  作者研究了矮壮素CCC处理对银杏光合作用、碳水化合物代谢、萜内酯含量以及萜内酯合成途径中关键基因表达水平的影响,旨在探讨外源CCC调控萜内酯生物合成的生理与分子机制,为CCC在银杏萜内酯的生产应用上提供理论依据。

1  材料与方法
1.1  材料与CCC矮壮素处理

  供试材料为银杏种子繁殖的3年生实生苗,用于繁殖银杏的种子采自品种为‘家佛手’的15年生嫁接苗,从2006年3月播种后一直生长于装满砂土(河沙︰腐殖土为1︰2)的陶瓷花盆中(直径25cm,高40cm,每盆一株),每盆用100mL的液态化肥(含有0.36g N、0.12g P、0.14g K)浇灌,每隔5d 灌溉1次。
  试验于2009年3—7月在长江大学园艺园林学院玻璃温室内进行,选取36株生长健壮且整齐一致的银杏苗作为试材。 将CCC矮壮素溶液处理设置为4 个浓度,即0(对照)、0.5、1.0 和  2.0 g · L-1(含有0.01% Tween 20 ,pH 5.8 )(冷平生 等,2004)。结合Wang等(2009,2010)以及本研究组前期CCC处理提高银杏叶片类黄酮的试验方案(程水源等,2004),本试验将处理时间设置为以下方式:待银杏苗有4 片新叶完全展开后开始进行CCC处理,对银杏苗全株叶片喷施,包括叶片正反面,使全部叶片表面湿润,每2周喷洒1次,25mL,处理时间为8周。每个处理设3个小区,每个小区设3 株重复,4个处理共计36株银杏苗。CCC矮壮素处理结束2周后于2009年7月8日上午8点至11 点进行光合作用测定,测定完毕后分别采收所有处理植株的叶片,每个处理各采收9株银杏苗,每株采收20片生长良好的叶片,从叶柄基部剪去叶片立即以液氮速冻,并迅速带回实验室保存于–80 ℃冰箱中用于其它指标的测定。

1.2  检测方法
  光合作用参数使用Li6400 便携式光合作用系统测定,在每株银杏苗自上而下的第5片叶上进行。
  叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量的测定参照Wellburn(1994)的方法进行,以mg·g-1鲜样(FW)表示。
  可溶性糖含量的测定采用蒽酮比色法,以mg·g-1鲜样(FW)表示。
  银杏内酯GA、GB、GC 和白果内酯BB 含量的分析采用大口径毛细管气相色谱法完成(廖咏玲等,2008)。总萜内酯含量以GA、GB、GC和BB含量的总和来表示。标准品购自于Sigma-Aldrich(USA)公司。萜内酯浓度以μg·g-1干样(DW)表示。
  银杏萜内酯合成途径中关键基因表达量的检测采用实时定量PCR分析(quantitative real-time RT-PCR,qRT-PCR )。5个萜内酯关键基因分别为1-脱氧–木酮糖–5–磷酸合成酶基因(1-D-deoxyxylulose 5-phosphate synthase,DXS),1–脱氧–木酮糖–5–磷酸还原异构酶基因(1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase,DXR),2–C–甲基–D–赤藻醇–4–磷酸胞苷酰转移酶基因(2-C-methyl-D-erythritol 4-phos phate cytidylyltransferase,MECT),香叶基香叶基焦磷酸合成酶基因(geranylgeranyl diphosphate synthase,GGPPS)和左旋海松二烯合成酶基因(levopimaradiene synthase ,LPS )。利用改良的CTAB 法提取各银杏叶样品的RNA(蔡荣  等,2007)。使用TaKaRa公司反转录试剂盒进行cDNA 第1条链的合成。选用看家基因18S rRNA 为内参基因。分别根据内参基因和目的基因的序列来设计荧光定量引物,引物序列与基因序列的GenBank 登录号见表1 。qRT-PCR使用TaKaRa公司SYBR Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒。定量检测使用TaKaRa公司的SYBR Green荧光定量技术,并使用相对定量法中的Ct值比较法计算结果。qRT-PCR 反应体系:SYBR  Premix Ex TaqTMⅡ(2x)12.5μL,Forward primer 1μL ,Reverse primer 1μL,cDNA 模板1μL,ddH2O 8.5μL ,共25μL。qRT-PCR程序为94℃预变性1min;94℃变性15s,56℃退火25s ,72℃延伸45s ,共40个循环。
  所有样品均重复测定3次,所有测定的数据用DPS数据处理系统进行处理,差异显著采用Duncan’s 新复极差法测验分析(P<0.05)。 
 表 1   银杏萜内酯合成关键基因表达分析引物

2   结果与分析
2.1  矮壮素CCC处理对银杏叶片光合作用的影响

  如表2所示,0.5、1.0和2.0g·L-1 CCC矮壮素的处理均能显著提高银杏叶片中净光合速率(Pn),气孔导度(Gs),胞间CO2浓度(Ci)和蒸腾速率(Tr),并且CCC矮壮素对上述光合参数的增效随着处理浓度的增加而增加,表明CCC处理能显著提高银杏叶片的光合作用。
表2 矮壮素CCC对银杏叶片中光合作用参数的影响

2.2  矮壮素CCC处理对银杏叶片光合色素及可溶性糖含量的影响
  如表3所示,0.5、1.0和2.0g·L-1 CCC矮壮素处理的叶绿素a、叶绿素b以及类胡萝卜素浓度均显著高于对照。其中1.0g·L-1CCC处理下的叶绿素a含量最高,2.0g·L-1CCC处理下的叶绿素b和类胡萝卜素含量最高。
  可溶性糖测定结果表明,0.5、1.0和2.0g·L-1矮壮素CCC处理的可溶性糖含量均显著高于对照(表3),比对照分别高21.4%、8.6%和28.7% ,表明矮壮素CCC对银杏叶碳水化合物的积累可能具有促进作用。 
 表3  矮壮素CCC对银杏叶片中光合色素参数的影响

2.3  矮壮素CCC处理对银杏叶片萜内酯含量的影响
  从表4可以看出,除银杏内酯C含量不受CCC处理的影响外,浓度为1.0和2.0g·L-1 矮壮素CCC处理的银杏内酯A、银杏内酯B、白果内酯及总萜内酯含量均显著高于对照,且以2.0g·L-1的含量最高,相对于对照分别提高了18.6%、12.5%、17.5%和14.8%,表明CCC能促进银杏叶萜内酯的积累。
表4   矮壮素CCC对银杏叶GA、GB、GC、BB和总萜内酯含量的影响

2.4  矮壮素CCC处理对银杏萜内酯合成途径中关键基因表达的影响
  为检测RNA反转录成cDNA 的质量是否符合后续qRT-PCR 分析,选用表1中银杏萜内酯合成关键基因的特异引物进行了qRT-PCR 检测,qRT-PCR 图谱见图1。如图1所示,PCR产物荧光定量显示GGPPS、DXR、DXS、LPS与MECT基因特异引物扩增产物的荧光曲线均成S 型,而且在23至40个循环之间,除负对照扩增产物的荧光定量无明显变化以外,所有qRT-PCR 扩增产物的荧光定量均呈对数增长,表明在qRT-PCR 体系中成功扩增出GGPPS、DXR、DXS、LPS与MECT基因片段,说明cDNA质量、特异引物匹配以及PCR程序均达到下一步目的基因表达量的定量分析的要求。
  为研究矮壮素处理对银杏萜内酯生物合成途径中相关基因转录水平的影响,检测了有关银杏萜内酯合成的5个关键基因的表达水平。结果如图2所示,DXS与DXR的表达水平在1.0和2.0g·L-1矮壮素CCC处理下均显著高于对照,GGPPS的表达水平在0.5和2.0g·L-1处理下均显著高于对照,LPS的表达水平在0.5、1.0和2.0g·L-1矮壮素CCC处理下均显著高于对照,而MECT的表达水平在0.5、1.0和2.0g·L-1矮壮素CCC处理下与对照均无显著差异。基因表达分析结果表明CCC能诱导银杏萜内酯合成途径中部分关键基因的表达。

矮壮素CCC生产和出口厂商:安阳市全丰农药化工有限责任公司,全丰矮壮素,全丰CCC

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